【课题套路】一篇NC教你组蛋白甲基化课题新套路

大家好，我是想课题思路想到裂开的无花果。

前几天国自然基金委公布生命科学部会评专家名单，预计九月，医学部的会评也将落下帷幕。

明年的基金申请即将开始，你准备好了吗？是否已经选定课题方向？

现如今，表观遗传学在疾病研究中的地位越来越重要，高分论文中不乏DNA/RNA/蛋白的甲基化/乙酰化研究。我们公众号已经陆续解读过研究热点m6A的课题设计思路（后续还会有关于m6A的各种技术帖哒），这一回让我们来看看组蛋白甲基化修饰的研究应该如何设计。

这篇今年3月发表于Nature Communication，题为“Histone methyltransferase DOT1L cordinates AR and MYC stability in prostate cancer”的研究论文就重点关注了组蛋白甲基转移酶DOT1L在前列腺癌中通过泛素连接酶调控雄激素受体AR和转录因子MYC的机制。

这篇文章乍一看是一个符合我们通常套路的研究，没有什么新意，然而仔细一读，就会发现整个研究过程虽然每一步都在这条路上，但最终呈现的结果却是一个比较新的调控机制。

首先，让我们先按经典的思路来分析一下这篇文章。

立项依据：

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，致死率仅次于肺癌。目前晚期前列腺癌的主要治疗方法包括靶向雄激素受体AR的治疗。尽管大部分的患者起初能够响应治疗，许多患者会发展为去势抵抗的前列腺癌（CRPC），影响治疗效果。其主要原因在于AR的持续信号转导，新一代AR靶向药物恩扎鲁胺（ENZA）的耐药性产生的原因之一就是AR通路的持续激活。

DOT1L是H3K79（组蛋白3第79位赖氨酸）甲基化酶，与转录激活、延伸、DNA修复等密切相关。以往研究发现DOT1L在急性髓系白血病的发病机制中起重要作用，以及在实体瘤中抑制DOT1L具有疗效，然而，DOT1L对前列腺癌的作用尚不明确。

本研究通过探索DOT1L在前列腺癌中的作用机制，开发针对前列腺癌的新型治疗靶点，具有潜在的临床应用价值。

为了探索DOT1L促进前列腺癌耐药性的分子机制，作者进行了以下预实验：

1. 用前列腺癌数据库和患者样本分析DOT1L与前列腺癌预后的相关性

作者选取了4个前列腺癌数据集（Grasso，Yu，Gulzar，Taylor）分析DOT1L表达量，并用4个数据集（Luca CancerMap prostate cancer，TCGA prostate cancer，Ross-Adams Discovery，TCGA Gleason）分析DOT1L表达量与患者预后的关系，发现DOT1L高表达与前列腺癌较差的预后相关。对患者肿瘤组织样本进行免疫组化检测H3K79me2，证实前列腺癌组织H3K79me2甲基化程度高。

2. 对前列腺癌细胞系使用DOT1L抑制剂（EPZ）观察细胞表型以及AR表达情况

克隆形成实验和细胞活性检测验证DOT1L抑制剂能有效抑制前列腺癌细胞生长和活力，AR阳性CRPC细胞（C42B），AR过表达细胞（22Rv1）以及ENZA耐药细胞对DOT1L抑制剂敏感。 

EPZ长时间处理后，AR转录水平不变，蛋白水平显著降低。

ChIPseq、RT-qPCR检测EPZ处理后AR下游基因表达，发现部分下调，但部分显著上调，与AR被抑制矛盾。（这就表明可能有另一个转录因子同时调控AR下游基因）

3. GSEA分析、AR靶基因预测、抑制MYC差异基因分析确定DOTL1同时调控MYC与AR

为了寻找DOTL1靶向的通路，作者首先对EPZ处理的LNCaP和PC3细胞中的转录因子进行GSEA分析，发现MYC通路显著变化，MYC靶基因在EPZ处理下被抑制。随后将MYC抑制细胞/AR靶向的显著差异基因进行比对，发现两者重合率高。WB显示仅EPZ处理的LNCaP细胞MYC表达量显著降低。（这些表明MYC通过AR依赖的机制受到DOTL1调控） 

4. EPZ处理后差异基因表达分析和对候选基因表达量分析找到EPZ调控的E3泛素连接酶

作者推测EPZ介导的AR/MYC受到抑制是由于两者蛋白稳定性下降造成，因此通过差异基因表达分析寻找候选的E3泛素连接酶。检测EPZ处理的前列腺癌细胞中候选基因的表达量，并敲减候选基因，检测AR和MYC蛋白水平，最终确定E3泛素连接酶HECTD4和MYCBP2。

5. AR激动剂（DHT）/抑制剂（ENZ）处理发现AR调控MYCBP2

为了进一步阐明调控机制，作者用AR的激动剂/抑制剂分别处理前列腺癌细胞并检测候选泛素连接酶的表达量，发现MYCBP2显著上调/下调。

于是最终确定的分子有：DOTL1、AR、MYC、HECTD4和MYCBP2。

基于以上结果，可以提出假说：组蛋白甲基转移酶DOT1L通过泛素连接酶HECTD4、MYCBP2降低AR、MYC的蛋白稳定性，从而抑制AR、MYC下游基因的转录。而MYCBP2又受到AR转录调控，形成反馈机制。差不多是这样的：

接下来进行体内外实验验证这个机制，再用分子实验验证一下几个蛋白之间的调控关系就完事儿了，一切看似是个包含老套路的新文章诞生。

你以为作者就会按照这个套路做下去？然而并没有。

作者认为，这样的机制没有说服力，不能代表这一调控的真实过程。（可能作者也做了AR与MYCBP2的ChIP实验，但结果是阴性）

因此，作者又检测了MYC敲减细胞在AR抑制剂处理下HECTD4和MYCBP2的表达量，发现两者无论是否有AR抑制剂表达量都显著上升。（这就提示MYC可能直接负调控HECTD4和MYCBP2！）

按往常的思路，只要验证MYC与HECTD4和MYCBP2的调控关系就能形成完美的反馈调节机制。

于是作者首先分析了一下临床数据中DOTL1、MYC和HECTD4、MYCBP2表达的相关性，结果悲剧了……如下图所示，MYC的表达量和HECTD4、MYCBP2并没有很强的相关性。

难道这一切只是假象？赶紧来个ChIP-seq数据压压惊。分析一通，发现MYC确实结合HECTD4和MYCBP2的启动子。RT-qPCR验证，结果也一样。

那么问题来了，为什么临床数据和实验结果不符？（反正是我我得抓狂）

作者想到了一个点：是不是和DOT1L只在肿瘤细胞中特异调控MYC这条通路有关？是否AR和DOT1L共调控MYC？（这一点都能想到反正我是服的）

于是作者开始了一系列验证操作：

1. H3K79me2 ChIP-seq验证仅LNCaP细胞中，MYC DNA的基因下游Enhancer区（增强子）H3K79me2甲基化富集，EPZ处理后富集消失。在AR的ChIP-seq结果中也发现MYC的Enhancer区。

2. PDX（患者来源的异种移植瘤）模型的ChIP-qPCR显示AR结合和H3K79me2位点。

3. 使用AR激动剂/抑制剂的ChIP结果显示，结合AR以及H3K79me2的MYC显著上升/降低。

4. 使用EPZ处理后，MYC Enhancer上的DOT1L、AR结合及H3K79me2甲基化均消失。

5. 细胞挽救实验证明EPZ处理后回转AR，能回复MYC Enhancer上AR、DOT1L、H3K79me2的结合，也包括H3K4me2、H3K27AC等。

6. EPZ处理后过表达AR，MYC mRNA表达水平回复，LNCaP细胞对EPZ的耐药性增强。

7. 用CRISPR/Cas9技术敲除MYC上AR结合的DNA区域，仅LNCaP细胞中细胞增殖受到抑制，MYC mRNA表达下降。 

其他的体内外验证都比较常规，有兴趣可以阅读原文和补充材料，附上链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-18013-7

最终，作者提出了以下机制：

前列腺癌细胞中，DOT1L和AR共同结合在MYC基因下游的enhancer区上调MYC的表达。MYC对泛素连接酶HECTD4和MYCBP2有负调控作用，泛素连接酶表达量下降，AR和MYC持续高表达。

当EPZ处理时，其与DOT1L结合，AR无法结合MYC的enhancer区上调MYC表达，HECTD4和MYCBP2表达升高，降解MYC和AR蛋白，进一步抑制AR和MYC基因的表达。（见下图）

总结

不得不说，这篇文章的开始是一个套路，但由于实验结果总是与预期有出入，迫使作者进行进一步的思考和不断推翻假设，又立起新的假设。与其说是一个新套路，不如说这是一个实验结果为导向的步步推论。功夫不负有心人，结合多个ChIP数据和体外验证，作者确定了最终的调控机制。

这就告诉我们，往往理想很丰满，现实很骨感。想象的和真实的机制可能相去甚远。但这篇研究论文也同时提醒我们，对实验结果的仔细分析和质疑、推论常常是科学研究的关键。希望大家都能像作者一样越挫越勇，从一堆看似矛盾、不理想的实验数据中找到隐藏的真相。

注：此推文未经许可禁止转载！

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